第四节    组织培养

    一、组培育苗的特点

    ⒈结合脱毒处理容易获得无毒苗，而无毒苗具有生长健壮，抗病性强，易丰产等特点，是今后生产用苗的趋向。

    ⒉繁殖周期短，繁殖系数高，能够达到速繁的目的，特别是在优质种源较少时，能在较短的时间内获得较多的个体。

    ⒊基本不受季节变化的影响，可周年繁殖。

    ⒋操作技术复杂，每个环节都不允许有一点失误，否则很容易导致生产失败，而且目前在欧李上存在成苗率低的问题。

    ⒌初始投入与运行费用都比较高，所以一般只用于繁育价值较高的苗木。

    二、欧李组织培养的基本操作

    1.外植体准备

    在春季生长旺季，于田间取健壮的当年生枝上未木质化和半木质化的部分，去掉叶片后在自来水下冲洗20~30分钟，剪成1厘米长的带腋芽的茎段。因取茎尖培养初代较不容易，所以多取腋芽培养。实生苗的子叶、胚轴也可作外植体，但诱导不定芽所需时间较长，且诱导出的不定芽易产生变异，所以生产中并不使用。在母本太少时也可取叶和叶柄作外植体。

    欧李当年生枝上的腋芽大部分在7月份开始进行花芽分化，其后即成为复合芽，用这样的芽子建立无菌系后难以进行继代培养,所以欧李的外植体取材宜在7月份以前进行。

    2.培养基制备

    ①培养基主要成分：不同植物在进行组织培养时对各种营养元素的需要量是不同的。大量试验表明，欧李在含盐量为中量的培养基上生长较好，且以英国人Murashige和Skoog1962年发明的MS培养基配方在经过适当调整后使用效果最好。一般使用培养基为A：1/2 MS大量元素+1/2MS微量元素+BA（0.1~0.2mg/L）+NAA（0.01~0.02mg/L）+糖（0.2%）+琼脂粉7g；B：1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+蔗糖0.2%。

    初代与继代培养都使用培养基A，生根时使用培养基B。在继代过程中常出现激素耐受量的变化，即激素效应钝化，也就是在同样的激素条件下增殖率降低，生长周期变长。在此条件下，若加大激素量就会恢复到较为正常的增殖率和生长周期。理论上讲，一次取初代，可无限进行继代培养，但为了避免激素钝化的影响，可在1~2年后重新做初代一次。

    ②培养基制备程序：配制培养基时为减少工作量，一般配成比所需浓度高10~100倍的母液，用时按比例稀释使用。在配制大量元素无机盐母液和微量元素母液时，要防止在混合时产生沉淀，为此注意各种药品必须在充分溶解后才能混合，而且要注意混合时的先后顺序。铁盐必须单独配制，因其与其它母液混合容易产生沉淀。为操做方便和节约时间，生长调节剂也配成一定浓度的原液，使用时按需要量取。下面为MS培养基母液配制表：

表4：MS培养基母液配制表

    需用量少时，微量元素、铁盐、有机物也可配成500~1000毫升的母液，生长调节物质配成50~100毫升的母液。母液配制好后贮存于2~4℃的冰箱中。

    在制作欧李培养基时，大量元素和微量元素取规定量的一半，铁盐和有机物质按规定量取。在做试验时，水都用蒸馏水，在生产中则可以选用纯净水或盐度较低的水。琼脂可用琼脂粉或琼脂条，但以琼脂粉使用较为方便。装培养基的容器多用玻璃器皿，，因其透光性较好。现在生产与实验中已不常用棉塞，而多用封口膜，或者直接用白色透明的塑料盖。但在欧李培养中，因塑料盖不透气，常出现小苗玻璃化现象。玻璃化苗就是培养的欧李苗呈水渍状，颜色较深，很脆，一碰就断。这样的苗既不能继代，也不能生根，应尽量避免。

    培养基冷却凝固后就可用于接种。

    3.培养方法

    将冲洗干净的带腋芽的茎段或其它外植体在超净工作台上消毒。先用70%的酒精消毒30秒，然后用升汞消毒5~8分钟，再用无菌水冲洗3~4次，最后用无菌纸吸去多余的水分。茎段的切口端要再次切去少许，然后接入初代培养基中，每瓶或每管只接一芽。

    接后的材料置于22~27℃、3000 lx的光照下培养，每天光照时间保持在12~16小时。约1~2周后腋芽萌发。当腋芽长至1~2.5厘米时转入继代培养基中培养，条件与初代培养相同。4~6周后，继代芽长到3厘米左右，切成长约1厘米的带芽茎段，再次继代。初代培养增殖率较低，随着继代次数的增加增殖率也增加，然后维持在一个平衡状态，再后来因激素钝化而逐渐降低。增殖率过小时成本会提高，增殖率过高时继代苗细弱，难以长成壮苗，生根困难。试验表明，增殖率以3~6倍为最佳平衡点。

    将继代苗转接到生根培养基上培养约1周后生根，约3~4周后即可炼苗移栽。

    三、组培苗的炼苗

    ⒈瓶中炼苗与移栽

    组培苗在生根之后需移入温室在强光下闭瓶锻炼一周，此后炼苗工作基本上都在温室中进行。温室中湿度保持在80%左右。其次需经常性地消毒，使空气含菌量保持在较低的水平。一般每周施放一次百菌清烟雾剂效果较好。

    经过开瓶锻炼，苗子即可移栽。移栽时先用镊子划破培养基，然后将苗子轻轻取出，在40~50℃的温水中洗去培养基，再于800倍多菌灵水溶液中浸泡15分钟，最后移栽于培养土中。培养土参考配方为：肥沃而不含杂质的园土2份，泥炭土1份，珍珠岩1份。配制好的培养土用高温蒸汽或0.5%的高锰酸钾进行消毒处理。

    小苗可直接移栽于铺设好的苗床，也可植于方孔育苗盘（盘底须有排水孔）。无论苗床还是放置育苗盘的地方都需底层排水良好，能使多余的水分迅速下渗。苗床的特点是土壤湿度容易控制，不易出现过干或过湿的状况，但在下次移栽时易有缓苗困难的问题。育苗盘中因土壤湿度弹性小，易过干或过湿，浇水时需细心，必要时可从底部渗灌，以防浇水不透。

    ⒉移栽后第一阶段的管理

    移栽完毕用小拱棚覆盖，然后用800倍多菌灵对拱棚内喷雾消毒。拱棚内湿度需保持在90%以上，温度保持在15~23℃之间，光强以中午的强光遮去70%为标准。本阶段浇灌要用无菌水。一周后喷施一次0.05%尿素和0.05%的磷酸二氢钾，以后每周一次，以保证小苗生长所需营养。

    移栽三天后，傍晚拱棚顶部打开一小缝，白天关闭。以后缝隙逐渐加大，直至全部打开，白天也不关闭。此时温室湿度保持在80%左右，其它条件基本不变。本阶段小苗的叶子逐渐增大，且叶色变得深绿，而高度基本没有增加，最后生长势逐渐变缓，甚至停止生长，叶子呈莲座状。莲座状的出现表明第一阶段基本结束，第二阶段即将开始。此时小苗已基本能适应温室环境。

    ⒊第二阶段的管理

    小苗在莲座状常常停留较长时间而没有明显生长，其机理尚不清楚，此时需适当提高温度，将其保持在15~25℃之间，而适当的温差会有利于苗子的生长。浇灌可改用放置一天以上的自来水，结合浇水5~7天用1000倍多菌灵灌根，以防止根腐病的发生。育苗盘中的小苗则需移入6×6（厘米）的营养杯中培养。

    当小苗开始二次生长以后，每隔5天~7天叶面喷施一次600~800倍果树氨基酸和500倍磷酸二氢钾以补充必须的营养。当小苗长至10厘米左右时，生长势再次变缓，此时叶片已接近正常叶，可开棚炼苗。开始炼苗后，逐步开大温室通风口，降低温度并增加光强。刚开始中午仍需较长时间的遮阴，以后逐步缩短遮阴时间，直至完全撤去遮阳网。经过5~7天的锻炼，幼苗基本能适应外界的环境，此时幼苗就可移入大田。在苗床培育的小苗必要时可先移入营养杯，经过短时间的锻炼再移入大田。

    ⒋组培苗在大田中的管理

    移植组培苗的苗圃地必须排水良好，土壤最好为富含腐殖质的沙壤土，土壤偏粘时须掺沙改良。小苗移入之前，最好将苗圃地深翻暴晒，暴晒能够有效地杀菌和改善土壤的理化性质。

    组培苗的栽植密度可稍大一点，以方便精细管理，一般密度为5×20（厘米）即可。刚栽植的小苗需遮阴1~2周，遮阴能够有效地提高移植成活率。浇水时需小水漫灌。小苗浇水后最好采取覆盖措施，覆土和覆盖干草均有良好的效果。采取覆盖措施可减少浇水的次数，而过多的浇水很容易使土壤板结，最后因根呼吸不良而死亡。

    组培苗在移入大田的当年生长量很小，有时几乎看不见其生长，入冬前仍需采取一定措施如秸秆覆盖等保证其正常越冬。第二年的管理比较简单，与播种苗等的管理基本相似。组培苗第二年的生长量可达60~70厘米。秋天，组培苗可出圃移栽。